Desmond（戴斯蒙）一觉醒来发现自己被一群人给抓了，他们自称是圣殿骑士，并且知道Desmond是刺客，需要通过Desmond的DNA来探索古代一些伊甸园圣器的信息。
于是Desmond就只能被迫进入一台叫Animus的机器，来读取自己祖先留在DNA里的记忆。他读取到了一位刺客大师Altair（阿泰尔）。
Altair作为刺客首领Mualim最得意的弟子，被派遣一项任务和两名刺客兄弟去一个古墓中拿取一件宝物，但当Altair到达的时候发现圣殿骑士已经取得了宝物。
Altair高估了自己的能力硬碰硬，结果害死了自己的一个兄弟，另一个兄弟夺回了宝物死里逃生。于是回来后Altair被贬为最低等的刺客从头开始学习。
同时，师傅Mualim让Altair刺杀九位圣殿骑士首领。Altair一步一步完成任务，但直到杀死最后一位圣殿骑士首领Robert（罗伯特）之后，他才知道原来自己的师傅Mualim是深深隐藏着的第十位圣殿骑士首领，为的就是利用Altair取得宝物，还能干掉自己的同伙。
当Altair返回刺客马西亚夫城堡的时候，Mualim已经对那件宝物——伊甸园圣器金苹果有所研究，并得到了巨大的力量，但Altair作为正统的刺客，凭自己不屈的毅力杀死了背叛刺客的师傅。回到现代，圣殿骑士们已经对金苹果有所了解，Desmond面临着被处死的危机。
同时，他发现在Animus中呆久了之后，学会了Altair的一项独特刺客技能——鹰眼，并通过鹰眼发现了地面、墙壁上的血迹。原来在他之前已经有人被这样当做实验品，但不幸死亡。（那就是16号，Desmond是17号。）
Desmond在刺客信条1之后本来是准备要处死的，但是Lucy帮他逃了出来，和另外两个现代刺客会合。
为了找到伊甸园圣器的下落，Desmond不得不再次进入刺客兄弟会的机器Animus 2.0，这一次他成为了中世纪佛罗伦萨的贵族Ezio Auditore（艾奇奥）。Ezio的父亲和两个兄弟被陷害以后，他在自己的叔叔Mario Auditore（马里奥）的帮助下脱离险境，并且知道自己的家族是刺客家族。
于是他开始自己的复仇之路。在复仇的过程中，Ezio慢慢知道了伊甸园圣器的事，并且自己也在慢慢成长，直到有一次圣殿骑士从外地运回威尼斯一件很重要的物品，被Ezio夺到，原来就是金苹果。
于是Ezio发现一个事实，就是在罗马有一件伊甸园圣器“教皇权杖”，它和“金苹果”结合就能打开一些秘密。于是刺客们就前往罗马，一来为了杀死陷害Ezio一家的罗马教皇Rodrigo Borgia（罗德里格·波奇亚），二来为了抢夺教皇权杖。
谁知Rodrigo早有准备，反刺伤了Ezio，抢了他的金苹果。但是Rodrigo没有刺客的血统，结合了教皇权杖和金苹果，但却无法激活。
而后Ezio赶来，两人赤手空拳搏斗，Ezio最终胜利，但心一软没有杀死这位陷害自己一家的幕后主使。
Rodrigo逃脱。Ezio身为正统刺客，发现自己的血统使两件伊甸园圣器合体激活，打开了罗马教堂地下的一间密室，而密室中出现的影像却是给后来人，也就是给现代正统刺客Desmond的信息。
然而回到现代，正在此时，圣殿骑士出现，Lucy和Desmond不得不展开战斗，Desmond通过Animus的血统效应已经学会了Ezio的一些技能，击退了圣殿骑士以后逃离。
Desmond和Lucy一行人一直逃到蒙特奥吉欧尼，也就是中世纪Ezio叔叔Mario的庄园。他们开始继续搜索金苹果的下落。
回到Animus中，Ezio打败Rodrigo之后载誉归来，回到Mario的庄园，但不想第二天凌晨，Rodrigo的儿子Cesare Borgia带兵攻打庄园，并最终抢夺了金苹果，还杀死了Mario。Ezio也只能带伤逃离。
逃离了以后，他孤身一人来到罗马，再次踏上了复仇之路。在Machiavelli（马基亚维利）、Da Vinci（达芬奇）和罗马当地的佣兵、交际花和盗贼的帮助下，Ezio解放了罗马，拿回了金苹果，并最终杀死了Cesare。
夺回金苹果后，Ezio把它埋在了罗马大剧场地下的一间密室里。回到现代，Desmond等人立即赶往罗马大剧场遗址，并进入密室，拿到了金苹果。但Desmond一碰到金苹果之后就被控制，不由自主走向Lucy，刺杀了她，随后陷入了昏迷。
Desmond昏迷之后，其他刺客急忙将他放回了Animus，希望通过Animus能让他苏醒。在Animus中，Desmond的意识和肉体已经分离，他的意识遇见了另一位在Animus中游荡的“16号”意识，来自一位现代已经遇害的刺客。
Ezio为了寻找古老刺客的知识，来到了Altair所在的马西亚夫城堡，发现一间Altair建造的密室。为了打开密室，Ezio必须找到五把Altair留下的钥匙，而这些钥匙已经被当时马可波罗的父亲带去君士坦丁堡埋藏。
到了君士坦丁堡之后Ezio卷入了宫廷斗争，还认识了一位有魅力的女人Sofia（索菲亚）。找到五个钥匙之后，Ezio和Sofia一起回到了马西亚夫城堡，打开了密室，见到了Altair的遗体和Altair留下的另一个力量更强大的金苹果。
这时金苹果又被激活，Altair、Ezio和Desmond的意识完全同步，Desmond聆听了人类诞生前的文明留下的信息，需要Desmond拯救世界。
在那之后，Ezio扔下了身上的武器，把它们和金苹果放在一起留在了密室，结束了自己的刺客生涯。回到现代，Desmond从Animus中苏醒了过来。
本作剧情设定在1753年至1783年间，场景主要发生在纽约和波士顿。主角是一位叫Connor（康纳）的英美混血儿，父亲是英国人，母亲是美国原住民。
在《刺客信条3》的开局阶段，玩家将体验Conner的父亲，到了第四章就会体验康纳的生活，当时他由莫霍克族（原住纽约州的印第安人）抚养长大。
在英国殖民者进攻并烧毁了Conner的村庄后，他最终走上一条对抗（和圣殿骑士）的道路。本作的故事仍然以刺客组织与圣殿骑士的斗争为主线。
由于故事发生在美国独立战争时期，主角将会在游戏过程中遇到众多著名历史人物，乔治·华盛顿、本杰明·富兰克林、查尔斯·李等人都会悉数登场。其中主角与华盛顿的互动将是本作中的核心关系之一，查尔斯·李将是本作的最终BOSS。
育碧在科隆游戏展上向媒体透露，《刺客信条3》的海战部分将在游戏中占一整条任务支线。游戏的主线场海战，如果玩家喜欢的话，可以继续在支线任务中体验。完成支线任务将得到金钱奖励，并且可以升级船只。
剧情将向我们解释，为什么康纳会得到晋升，并拥有自己的船只。虽然《刺客信条：启示录》中的塔防元素非常鸡肋，影响了游戏的主体，但这次添加的海战似乎与游戏主体非常搭调。
游戏中的海战场景由育碧新加坡分部负责，但其中也包括很多登船作战的时候，这些就是由育碧主要的《刺客信条3》团队负责的了，海战与刀剑的结合让游戏充满新鲜感。
玩家最开始的船很一般，搭载常规大炮。玩家可以升级船只的外壳（增加船只HP）和大炮，解锁火炮铁链，燃烧炮弹和散射炮弹。